要保证DNA结构的完整性和DNA的纯度

在pH值为12.0～12.6的碱性环境中，在去垢剂SDS的作用下，细菌的细胞壁与细胞膜均破裂，释放出大量的染色体DNA、RNA及质粒DNA。此时，所有双链DNA解聚成单链，但质粒DNA仍保持环状。当pH值恢复到中性时，在高盐浓度下，大分子量的染色体DNA只是部分复性，相互交织成不溶性的网状结构，与细胞碎片、部分蛋白质和大分子量的RNA一起沉淀，并可通过离心除去。而环状的质粒DNA可以完全复性，溶解于上清中，从而达到初步分离的目的。

采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA

1．取1.5ml过夜培养的菌液，12000 rpm，离心30s，弃上清，尽可能倒干，收集菌体沉淀。

2．用100μl 溶液I（50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）重悬菌体沉淀，Tip吹打至彻底悬浮。

3．加入150μl 溶液II（0.2mol/L NaOH, 1% SDS），轻轻颠倒混匀4~6次，使充分菌体充分裂解，室温放置5 min，直至溶液变得清亮。

4．加入150μl 溶液III（4mol/L 盐酸胍，0.5mol/L KAc pH4.2），立即温和颠倒混匀4~6次。室温放置5 min，12000 rpm离心10 min，小心吸取上清。

5．加入400μl 结合缓冲液（5mol/L 盐酸胍，20mmol/L Tris-HCl pH6.6, 37.5%乙醇）于离心吸附柱中，然后将步骤4中的上清加入吸附柱中（不要将沉淀移入吸附柱），混匀，套入收集管中，12000 rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液。

6．加入750μl 漂洗液（20mmol/L NaCl, 2mmol/L Tris-HCl pH7.5, 80%乙醇）于离心吸附柱中，静置1min ，12000 rpm离心15 s，倒掉收集管中废液。

7．重复步骤6一次。

8．再次于12000 rpm空离心2 min，尽量除去漂洗缓冲液中的乙醇。

9．取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml Eppendorf管中，在硅基质膜中央部位加入50μl洗脱缓冲液（10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA pH8.0)，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。

10．丢弃离心吸附柱，溶液中含有目的质粒DNA，置于4℃或－20℃保存。